一、植物简介

菜豆(Phaseolus vulgaris L.)又称四季豆、芸豆、扁豆等，分为食豆和食荚两种类型，菜豆在我国各省市均有栽培，种植范围十分广泛，是我国重要的粮食作物和蔬菜作物。菜豆能为人类提供丰富的蛋白质、碳水化合物、维生素及矿物质等，尤其嫩荚是人们喜食的蔬菜之一。

二、培养条件

增殖培养基为MSB5+6-BA5.0mg/L，生根培养基为1/2MSB5+IBA0.1mg/L。培养室环境温度为25℃，光照强度4 000lx，光周期为16h光照，8h黑暗。（将MS培养基中的有机成分换成B5培养基的有机成分，其他成分不变，缩写为MSB5）。

三、材料与方法

挑选籽粒均匀一致的菜豆种子，放置于玻璃容器中，用25%次氯酸钠处理20min，无菌水洗涤5-6次。

四、生长与分化叶子分割线

在超净工作台上，取生长5-6d的2叶1心的无菌苗，放置于灭菌后的培养皿中，切掉胚根及2片真叶，保留叶柄，作为外植体备用。将处理好的外植体的下胚轴部分插入增殖培养基中，插入深度0.5cm左右。而后，切取通过快繁获得的均匀一致的再生植株，插入生根培养基培养基中，进行生根培养。

五、炼苗移栽

先将生根后的组培苗开盖炼苗3-4 d，后将组培苗连瓶一起放置温室内炼苗3-4 d，炼苗结束后将组培苗取出，在水中除掉根部的培养基，尽量使再生根完整。移栽基质为草炭：蘑菇渣=1：1。将完整的组培苗移栽到移栽完的营养钵放置在有塑料薄膜覆盖的小拱棚内，移栽后前3d适当向拱棚内喷水，保证拱棚内相对湿度达100%，3d后逐渐放风直至除掉拱棚。

自从1902年德国科学家Gotdieb Haberlandt提出植物细胞的全能性理论后．细胞全能性研究逐渐成为生物学研究领域的热点．而建立在细胞全能性基础上的植物组织培养技术从此逐渐兴起和发展。国外科学家较早地深入研究植物组培技术，如：1934年，美国White通过对番茄离体根的培养，形成了第一个可以正常生长的无性系，从而使非胚器官的培养首先获得成功；1937年，White以种间杂种烟草茎段的形成层为材料，成功地进行了植物组织培养和继代培养；1943年，White出版了专著《植物组织培养手册》，标志着植物组培技术开始成为一门新兴的科学和技术。此后，更多的国外科学家和学者对植物组培技术不断地进行探索与创新，并建立的许多重点实验室和公司，实现了组培的产业化。而我国对此却鲜有贡献， 仅于1933年，李继侗进行银杏的离体培养时，证明了大小约3mm的幼胚能正常生长。当然，不能以此否定完我国的组培技术。20世纪70年代，我国学者首先完成了20多种植物的花粉培养，使我国在这一领域处于世界领先地位。由于先天的不足，总得来说，目前我国仍处于追逐国际的状态。  

国内外植物组培在技术创新上的差距

1、在研究的系统性方面

国外研究品种多，不仅研究种间差异，还研究无性系间的差异。我国虽研究范围广，但系统性差。目前几乎所有现赏植物都曾进行过组织培养，但多数局限干培养的最终结果或围绕结果的几个重要因素的研究。  

2、在研究的深度方面  

国外除了研究通过植物组织培养各种途径再生植株外，更为重要的是对植物组织培养苗各阶段的生长特性，遗传稳定性及组培苗田间表现等方面进行了研究。而我国继代培养的代数普遍偏长，且很少追踪组培苗田间表现的研究。

3、在技术环境及条件控制方面  

国外在组织培养技术及培养环境条件控制方面的工作做得更细，更精，根据不同种类，不同生长阶段在培养条件上进行不同控制。这些研究对于促进植物组培快繁技术体系的完善和实现组培苗商品化、工厂厂化生产都是十分必要的。国内有关组织培养方面的研究报道，重复性研究很多．但试验结果的可重复性较差，多数报道只有结果，对所采用的技术手段和原因分析较少。  

4、在培养方式方面  

发达国家采用穴盘营养液无糖培养方式．有效地降低了成本，其培养室内的光照，光质，光周期，温湿度、二氧化碳浓度等全部采用自动控制。而我国多数还是采用基质容器的粗放培养。  

国内外植物组培在产业化的差距

1、在技术与产业结合方面  

发达国家特别注重产业化，从事组织培养的研究机构都与产业相结台，他们征实验研究、开  发推广到生产试验上的经费投放之比为1：10：lOO。而我国的研究机构大多游离于产业之外，使技术和产业分离。加之科研主管部门的研究经费大多投入在前期的基础研究上，而对中试和进一步产业化的投入则远远不足，这就是导致我国目前组培育苗产业化程度不高的主要原园之一。  

2、在污染率控制方面  

国外新型工厂化组培苗的生产，从培养基的制备、消毒、存储，植物的接种、     培养、观察等都是在无菌工作间进行的，降低了污染率，提高了工作效率。而在国内，由于资金有限，除了在接种台上必需的无菌操作外，其它的都是在自然空气中，加之培养室环境控制不好，污染率较高，致使损失严重。此外，国外组培设施设备、环境条件和人员素质优于我国，对组培产业化生产的管理比较规范，并使用比较合理的防污染药剂，组培的污染率可以控制任5％以内。但我国组培室周围大都没有隔离，组培苗的污染率往往超过5%。还有就是缺少管理经验，对污染的危害性认识不足，缺乏对污染源的诊断与对症下药。

3、在生产自动化程度方面  

在组培产业化中为节省人工，减轻强度，国外已开始在培养基容器的清洗，培箨基配制、分装、灭菌和搬运中建立自动化和半自化生产线和设备。现代他的智能化温室较普遍用于植物组培苗的移栽，并用电脑进行自动控制。而国内目前组培苗的生产尚未实现机械化与自动化。仍以人工为主，存在速度慢、劳动强度大，成活率低。生产成本高等问题。  

4、在订单生产方面  

国外的组培公司都是按订单进行生产，国内普遍存在组培计划，生产段销售脱节问题。组培苗工  产业化生产是一个系统[程，只要其中的任何一个环节出现问题，都会影响到整个生产计划和任务的完成。所以征制定计划时要充分考虑到各种可能发生的情况，同时又不能能把余地留得太大，以免生产过多造成浪费和增加成本，或者不能按订单提供相应的产品。  

5、在监测技术体系方面  

荷兰已着手对组培质量监测技术体系进行研究。设在荷兰的SBW组培蛮验掌研究项目负责人彼得范德林特指出，为保证培养及生产工序的质量，必须实施一套标准化程序。范德林特说，质量包括很多方面，但有两个因素是非常重要的：一是产品的质量，另一个是生产工序的质量。而后者可以通过世界公认的生产标准认证如ISO或HACCP得到保障。  关于组培技术标准方面，在国际上由于大多数大的组培工厂都是公司性质，出于商业机密，基本不将组培技术标准公布于众。到木前为止，尚未见有国际标准、国家标准。  

6、在人员培训方面  

农业发达的国家和地区，农业专业技术人员都是经过严格培训的，而我国除了少部分农业技术员有机会接受专业技术培训外，大多数从事农业的人员都没有得到很好的培训。特别是组培业，很多参与组培厂管理和技术工作的人员都是工作后才真正接触组培，边工作边学习。少部分专门从事组培研究的专家却不能直接参与生产和管理，使得技术和管理不能有机地结合，从而影响了产效，尤其是能有机会出国接受专业培圳的人更是微乎其微。这种状况也影响了我国组培产业的研究和发展。  

7、在与其它新技术结合方面  

国外组培产业斗始向规模化、产业化、综台化和多样化发展，并与计算机技     术、信息技术自动化技术以及新材料结合，不仅进行植物的组培快繁，而且通过信息网络，进行组培生产和经营管理，以节省时间，提高生产效率，使组培产业化能持续健康发展。而国内组培事规模和档次不一，有的规模投入过大，设计不科学，装备不配套，难以以堵转和赢利；有的过于简陋，规模太小、难以投入生产使用；有些组培室建成后，由于缺乏市场、技术、人才和  管理，处于闲置状态。 

现在许多科研单位和花木生产企业都已配置了组织培养室。组培技术已成为重要的生物技术之一。然而有的组培室组培苗的数量和质量却一直没有质的飞跃，究其原因，最主要的因素就是污染所造成的。被污染后首先是生产成本的提高；其二，对植株造成伤害；其三，增加接种源受污染的机率。亚龙组培特整理此篇内容分享给大家，希望对有这方面困惑的朋友有帮助！

组培室常见污染源

组织培养过程中的污染源主要有以下几种：

（1）户外风大，菌类进屋机会多。有风就有沙，有沙就有尘，有尘就有菌，菌尘共存，这是菌类进屋的主要原因之一。

（2）屋内太潮，菌类繁衍多。需保持室内空气干燥，如使用空调“除湿”功能，也可减少真菌生长繁殖。

（3）人员带菌多。在整个操作室内，人员可说是最大的带菌者，不管在毛发或是衣服等地方，都隐藏着数不清的菌类。在进入操作室前，最好能对作业人员进行清洁处理，比如换上干净的白大褂，换上实验室的鞋，衣服鞋每星期洗一次，上超净台前手要用肥皂清洗两遍，接种前手再用酒精擦拭一遍。

（4）屋内不干净。紫外线能杀灭或抑制真菌生长，因此应在每次接种前进行20分钟的紫外灯消毒。

（5）清理屋内带菌组培苗。在植物病害中，真菌所引起的病害尤其严重，且因会产生孢子，随着空气飘散。一旦落入适当的环境下，一粒小小的孢子便会扩大成一个菌落，污染整个组织培养瓶。因此一旦有真菌污染的组培苗，就要用高压灭菌器彻底消灭，以防扩散。（6）接种不正确。不正确操作也会增加污染机率，如开盖太快，灭菌不够，操作过慢等。接种过程应该轻开盖，快操作。

组培室污染原因

若污染菌类是零星分散在培养基中，则可确定是人为引起的污染，比如培养基灭菌不彻底；超净工作台长时间不换滤网，致使净化能力降低；接种用具灭菌不彻底；操作不正确，动作生硬缓慢，开瓶时间太久，接种台摆放物品杂乱，操作中心在人体范围之内；接种室长期不灭菌，菌类太多等。

若污染菌类是从材料周围长起，则可证明是植物材料带菌引起。可能是接种用具灭菌不彻底，接种时材料被污染；或者是未及时发现污染苗，接种过程交叉感染等。

若菌类从材料培养基以上部分长起，而不是从培养基先长起，且发生在5天以后，则说明是材料带的内生菌。若从培养基以下开始长菌，发生时间较早，且有从里向外的趋势，则说明是切口引起的污染，原因可能是灭完菌后，未剪去两个切口或虽剪但器具带菌。

污染苗如何抢救？

真菌污染后，如果已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔掉，即使仅形成菌丝也应处理后扔掉，因为菌丝能够达到材料内部，因此，真菌污染是灭绝性的。

细菌污染后，由于细菌繁殖是靠芽孢，细菌不会弥散在整个空间，因此只要及时发现，可将材料上部未感菌的部分剪下转接，材料仍可以用。

组培室的污染来源一般可分为以下几方面：接种前污染、接种时污染、接种后污染、母本带菌。

一、接种前污染：培养基消毒不彻底

1、现象

培养基消毒不彻底，污染一般呈碟状出现在培养基内部，但也有在培养基表面或者瓶壁、瓶盖表面出现的。

2、原因

原因可能是由于灭菌锅加热不均匀，培养基量太多，瓶子没洗干净等。

3、应对

取若干批次培养基放置1～2周，观察污染出现情况，即可对灭菌成功率做出合适的评价。将培养基放置1周左右再用，可以实时监控灭菌成功率的同时具备较大的使用缓冲时间，以应对灭菌锅失效等突发情况。

二、接种时污染：员工操作或者相关除菌设备失效

1、现象

接种时带来污染，污染物一般贴着培养物生长，但少数情况下污染物也可能随机散布在培养基表面。

2、原因

这方面的原因包括员工操作不符合无菌操作要求，超净工作台高效过滤器失效，超净工作台风速过低，超净工作台表面没做好消毒，接种器具消毒不彻底。组培工厂一般员工的污染率通常在3%左右，而由技术员进行严格的接种操作时，污染率可控制到1%以下。如果一个组培工厂接种人员之间的污染率差异巨大，就应该在“接种时污染”这个方面去着手，寻求解决办法。

3、应对

应对的措施一般有定期检测机台过滤效果，检测机台气流大小，规范员工操作，检测高温消毒器，检测铁盘或者纸片的消毒效果。

三、接种后污染：培养过程中，由气流或小动物带来污染

1、现象

污染物一般散布在培养基表面，而不是贴着培养物生长。有时由小动物如螨虫或者蓟马带入时，还能在瓶内看到微小的爬动的虫子，这时的菌类污染物可能从瓶盖或者瓶壁向下生长，也可能在培养基表面长出弯弯曲曲的轨迹（沿着虫子爬行的足迹生长），螨虫污染的情况下，能观察到瓶壁有蛛网状细丝。

2、原因

原因可能是培养间洁净度较差，气流较快，使灰尘飘动较多；缓冲不良使蓟马飞入；培养间人员衣着不规范带来较多螨虫；或者没有对污染进行定期的监控，使虫子带来的污染有扩散的机会。

3、应对

首先应该分清污染源。如果发现污染有在瓶间扩散的迹象，最可能是虫子带来的污染。应即刻拧紧污染瓶盖并清除污染瓶。平时应注意培养间的缓冲区效果，规范员工衣着，定期清洁培养间，如每周拖两次地。培养间内可设置每晚臭氧消毒。最有效的措施还是定期检查并清除污染。

4、关于螨虫污染

这里再补充一下个人看法。在一般洁净程度的培养环境下，螨虫会随机出现。毕竟人体就带有螨虫。

观察到螨虫污染时，有更多未观察到的母瓶已经被污染。因为螨虫从瓶口爬到培养基上，在真菌菌落长出前这个阶段不能被观察到。当1筐材料有较多污染时应立即整筐丢弃。

有螨虫在瓶口螺旋内未能进入瓶内，这样的母瓶在转瓶前一直是洁净的，在转瓶后会爆发污染。

可能有少量不带霉菌孢子的螨虫进入瓶内，因而不能被观察到。这样的母瓶会被忽视并成为隐藏的传染源。当螨虫在瓶内大量繁殖，在瓶口进进出出，最终会出现真菌污染。

为控制螨虫污染，筛查是最主要措施，打药效果并不明确。筛查操作应该每3～7天一次，坚持到整个培养间的螨虫污染率降到0.1%以下。然后每周全面清理霉菌污染，直到未发现疑似螨虫污染。

遇到螨虫爆发，往往是平时管理不善。这时看到明显污染的只是一部分，更多的瓶子已经有螨虫但未能被轻易观察到。因此发现螨虫爆发后即使立即清理污染瓶，后续还是会出现污染持续增多的现象。配合着坚持筛查，污染量出现高峰后会逐渐下降，而整个“螨虫病程”估计将持续2～3个培养周期。应对措施良好的情况下，3个周期后应该能将螨虫量控制到正常的水平，但此后也应该有持续的监控措施。

四、母本带菌：组培物本身有内生菌，或外植体消毒时保留了轻微带菌的材料

1、现象

这类污染必然紧贴着培养物表面开始出现的。这类污染既然能被保留下来，进行带菌组培，一般生长较缓慢，在培养基内呈较难观察到丝状。但随着培养代数增加，污染物的生长速度也可能变快，污染变明显（原因可能是经过较长时间细菌出现了快速生长的变异，然后占据了生长优势）。

2、原因

一般植物体内都或多或少地有内生菌。轻微的污染不易被察觉，也不太影响培养物的生长，易被保留。

3、应对

对于有内生菌问题，那就尝试使用没有内生菌的材料，包括茎尖脱毒处理等。同一批母本得到的培养物，也可能有少部分不含内生菌的材料，仔细挑选着部分材料进行扩繁，其余的也可利用几代。如果内生菌一直不影响组培物生长，也可以无视。

对于轻微污染的情况，应该在一开始就尽可能仔细地挑选出无菌材料进行重点扩繁。当然，合适的接种操作也可以将轻微污染一直控制在可控的范围，如每次转瓶时都切除所有老组织，只用新的组织进行扩繁或出苗。